SDR是否可以測量外部代謝產物對葉片O 2消耗率的影響。具體而言，先前在代謝物對葉片O 2消耗速率的影響（使用Astec Global的Q2）中進行了觀察，觀察到10 mM脯氨酸（Pro）在14小時內引起大約兩倍的呼吸速率刺激。該測量的關鍵方面是持續(xù)時間（> 14小時）及其動態(tài)性質，因為我們對速率隨時間的變化感興趣。我采用了SDR設置，因此可以測量包含樣品的試管頂部空間中的氧氣。

背景：需要進行植物呼吸測量

     呼吸通量和光合速率是常規(guī)適用于植物的代謝通量測量方法，因此兩者都是了解植物生物化學和理學的關鍵工具。當前存在幾種可以測量植物呼吸氣體交換速率的技術，例如用于CO 2的紅外氣體分析儀和用于氧氣的Clark型O 2電極。兩種技術都具有低通量和持續(xù)時間短的測量技術，這阻礙了大規(guī)模的實驗設計，例如，這些實驗設計將用于植物育種者。澳大利亞研究委員會植物能量生物學中心（PEB）一直處于開發(fā)和試用用于植物的新呼吸測量技術的前沿。具體來說，使用O2依賴于熒光的猝滅已被用于多種高通量技術，例如SDRSensorDish®Reader，Seahorse或Astec Global的Q2。然而，在植物科學中很少使用這些技術，特別是海馬使用漂浮的植物組織的應用受到限制[1]。盡管我們已經嘗試過將標準SDR與先前帶有傳感器斑點的玻璃板結合使用，但是斑點在井底的位置與涉及液體和頂部空間的測量不兼容。目前，PEB的許多呼吸研究均依賴于第二季度。該機器基本上使用自己版本的傳感器點，這些傳感器點位于頂部螺旋管的蓋子和自動傳感器臂中。Q2可以很好地與各種植物組織配合使用，并且可以大大提高測量能力，如Scafaro et al。，2017 [2]中所評估。簡單的管和蓋設置也適用于液體介質的測量。這是一個很大的優(yōu)勢，因為它允許將化學物質引入呼吸測定法，從而大大擴展了其用途[3]。因此，我想測試SDR是否可以與Q2搭配類似的設置（帶有管和傳感器點帽），以及它是否具有*的測量性能。

     圖1：SDRSensorDish®閱讀器設置，用于葉盤呼吸測量。將葉片切開并漂浮在固定在底部架子上的螺帽管內的緩沖介質上。旋緊瓶蓋。頂部機架適配器已放置在上面。特別提款權倒掛。

材料與方法

    實驗設置簡單，快速（圖1）。當總容量為856 µL的塑料螺帽管充滿600 µL緩沖溶液（50 mM HEPES，10 mM MES，200 µM CaCl 2，pH 6.6）在存在或不存在10 mM Pro（或所需的任何其他化學物質）的情況下，留有256 µL的空氣頂空。將7毫米的葉盤打孔并漂浮在溶液上，并蓋上管蓋（n = 10）。所有測定中均應包括無葉盤的空白試管，因為它們必須去除大量背景噪音并提高數據質量。然后使用兩個3D打印適配器（PreSens）組裝SDR。一個SDR大約需要15分鐘的設置時間。提供的蓋子和管子是高質量的?？紤]到適配器的小設計，該單元的組裝非常堅固。在室溫下黑暗中收集氧氣數據。該測定以15秒的間隔進行過夜（?17小時）。數據已導出到Excel進行分析。

結果

     圖2顯示了一項實驗的氧氣測量結果，該實驗比較了用SDR記錄的未經處理的葉片與經過Pro處理的葉片。這些值用于進一步的消耗率計算。我通過減去無葉盤的空白試管中的平均消耗率來校正O 2消耗率隨時間的變化。然后將速率計算為移動1.5小時窗口（圖3A-B）。O 2消耗率軌跡隨時間的平滑度是用于計算移動斜率的時間窗口的函數：更大的窗口等于更平滑的軌跡。但是，出于本實驗的目的，空白消減后殘留的噪聲不是一個因素。根據Scafaro等人的方法，將O 2百分比轉換為摩爾值。2017 [2]。

     圖2：用SDR記錄的未經處理（左）和經過Pro處理（右）葉盤的氧氣測量值。一個實驗的數據。經Pro處理的葉盤的刺激呼吸清晰可見。

    結果表明，SDR板與管和蓋的設置相結合，再現了以前使用Q2獲得的結果。對照葉片中O 2的消耗率隨時間逐漸下降（圖3A，C）。在Pro處理過的圓盤中，如預期的那樣，從開始孵育4小時開始，O 2消耗率隨時間增加（圖3B，C，D）。在圖3D中，我們比較了兩種不同的擬南芥基因型。該測定法能夠通過重復六次檢測先前觀察到的品系間表型差異。

資料品質

    關鍵因素是測量之間的技術差異。與其他呼吸測量設備相比，對照治療的重復痕跡顯示出較低的技術變異：變異系數為22.7％（其中包括生物學變異，因此潛在的技術變異更低）。較低的CV至關重要，因為它使確定具有合理重復次數的樣品類型之間的差異變得更加容易。在Pro處理過的葉盤中，由于生物變化，對Pro的響應在葉盤中不太均勻，因此可以預料到Pro處理過的葉盤中O 2消耗率的變化會增加。
    15 s的測量頻率足以解決數據中隨時間變化的模式。通過將設備放置在培養(yǎng)箱中來控制溫度的能力是植物呼吸研究的另一個優(yōu)勢。

    圖3：暴露于外源性化學物質時葉盤中O 2消耗率的測定。在有或沒有10mM Pro的條件下孵育擬南芥葉盤，并在約15小時的黑暗中測量O 2耗竭率。通過減去含有緩沖液但沒有葉盤的四個試管的平均速率來校正速率。（A，B）對照和Pro處理的WT葉盤的單個跡線（n = 10）。（C）來自A和B的平均跡線。（D）來自Pro和對照處理的WT和突變株的平均跡線，相對于未處理的WT速率顯示（n = 6）。突變株顯示出部分缺乏Pro的呼吸刺激。